Průkaz okultního krvácení ve stolici - FOBT - screening KRCA

Poslední aktualizace: 3. srpna 2011

Klíčová slova

Okultní krvácení, screening, kolorektální karcinom, guajaková pryskyřice, Haemoccult, TOKS, gFOBT, imunochemická detekce, iFOBT, kvantitativní stanovení hemoglobinu, qi-FOBT, molekulární markery - DNA, PCR

Screening kolorektálních tumorů

Riziko karcinomu tlustého střeva v populaci v České republice trvale narůstá, v roce 2010 dosahuje hodnot 80 na 100 tis. obyvatel a v evropském srovnání je nejvyšší hodnotou.

Kolorektální karcinom (KRCA) vzniká malignizací adenomu sekvencí genetických mutací v průběhu průměrně deseti let a převaha nádorové tkáně je alespoň v počáteční fázi onemocnění lokalizována intraluminálně. Menší část kolorektálních karcinomů vzniká při přítomnosti rizikových faktorů, jako jsou nespecifické střevní záněty, familiární adenomová polypóza, hereditární nepolypózní kolorektální karcinom a další hereditární syndromy. Již v asymptomatické fázi onemocnění karcinom (a adenomový polyp) intermitentně krvácí. Polypektomie adenomu znamená v podstatě vyléčení a pětileté přežití po kurativní resekci nádoru omezeného na stěnu střeva přesahuje 80 %. Vzhledem ke všem těmto skutečnostem je časný záchyt (screening) nanejvýš žádoucí a je technicky schůdný. V celopopulačním screeningu hrají hlavní úlohu – kromě výtěžnosti zjištěné na principu vědeckých důkazů – cena a způsob provedení, který musí být pro většinu populace dobře přijatelný. Doporučení EU pro screening a diagnostiku KRCA zahrnují samozřejmě i další podmínky zajištění kvality, včetně systému externí kontroly kvality - EQAS.

Screeningové programy zahrnují laboratorní metody detekce okultního krvácení - FOBT (Fecal Occult Blood Test) - TOKS (Test okultního krvácení ve stolici), detekci genetických markerů a ze zobrazovacích metod se ve screeningu uplatňují sigmoidoskopie, koloskopie, irigografie a »virtuální« kolografie s použitím výpočetní tomografie (CT) či magnetické rezonance (MR).

Zobrazení endoskopických obrazů adenomů v databázi GastroAtlasu.
Přímý link k vyhlednání adenomů je zde: GastroAtlas - adenomy,
- zobrazení sekvence odstranění adenomu endoskopickou polypektomií, včetně použití chromodiagnostiky, zobrazení struktur a zvýraznění epitelu metylénovou modří - GastroAtlas - sekvence 001,
- zobrazení sekvence odstranění stopkatého polypu v sigmoideu - GastroAtlas - sekvence 020.
V databázi GastroAtlasu si můžete vyhledat i další sekvence, obrazy karcinomů, endoskopické, RTG a endo-sonografické obrazy.

Incidence kolorektálního karcinomu, obrázek LG_342

Jsme-li v něčem, v Evropě první, tak je to incidence KRCA. Trend za posledních 40 let se přiliš nemění, spíše zhoršuje. V roce bylo nalezeno nových KRCA 1960/15 na 100.000; 1970/25; 1980/35; 1990/45; 2000/75 (již jen ČR). Trend méně výrazné, fialové barvy - počet úmrtí, je výrazně nižší a vzájemná křivka se otevírá. V roce 1960 zemřelo více než 90%, v roce 2000 jen 60%, a matematik Vám proloží křivku a spočte, ze v roce 2023 zemře již jen každý druhý.

Virtuální kolonoskopie pro screening KRCA, obrázek LG_346

Pozitivita FOBT testu vyžaduje provedení totální kolonoskopie. Přestože v ČR máme nejvyšší indidenci KRCA, provádíme screening Haemoccult testem, tak odezva (provedení totální kolonoskopie) - na pozitivní FOBT - je v ČR velmi nízká. Diskutována je dnes varianta virtuální kolonoskopie, porovnávána citlivost s klasickou - optickou kolonoskopií. Polyp velikosti 1cm lze bez problémů zobrazit CT technologií (pokud víme, kde je lokalizován). Počítač dokáže zpracováním tisíců CT obrazů ve 3 rozměrech vygenerovat virtuální obraz střeva, vyhledat a zobrazit polypy.

Frekvence kolorektálních nádorů v jednotlivých částech TS, obrázek LG_356

Proximodistální gradient degradace hemu, resp. globinu, a citlivost FOBT testů - obrázek LG_353 je třeba zohlednit vzhledem k frekvenci kolorektálních nádorů v jednotlivých oblastech tlustého střeva. Téměř 1/3 - 30% nádorů je lokalizováno v oblasti vzestupného tračníku (colon ascendens), čímž je mj. také zdůvodněn požadavek totální kolonoskopie při prokázané pozitivitě screeningového testu FOBT.

Externí kontrola kvality (EQAS) testů TOKS, obrázek LG_629

Doporučení EU pro screening a diagnostiku kolorektálních nádorů zahrnuje samozřejmě doporučení pro zajištění kvality FOBT testů a to především testů kvantitativních, kde lze tuto externí kontrolu kvality spolehlivě zajistit stejně jako je to zabezpečeno u dalších biochemických analytů. Externí kontrolu detekce Hb ve stolici nabízí v ČR firma SEKK.

Reference
Duffy MJ. - Int J Cancer. 2011, Medline - link
Berchi C. - Int J Technol Assess Health Care. 2010, Medline - link
Parente F. - Br J Surg. 2009, Medline - link
Ahlquist DA. - Ann Intern Med. 2008, Medline - link
Rennert G. - Cancer Lett. 2007, Medline - link
Summers RM. - Gastroenterol. 2005, Medline - link
Pickhardt PJ. - Eur Radiol. 2005, Medline - link
Pickhardt PJ. - New Eng J Med. 2003, Medline - link

Detekce okultního krvácení

Indikace tohoto stanovení je zásadní otázkou pro TOKS-FOBT testů detekce okultního krvácení.
Screening, jako úvodní metoda depistážních programů pro vyhledávání kolorektálních nádorů u asymptomatických jedinců, je nutno provádět testem, který splňuje stanovená kriteria. Depistážní programy jsou založeny na opakovaném stanovení v pravidelných intervalech jednoho až dvou let. V případě pozitivního výsledku testu musí následovat cílené gastroenterologické (endoskopické) vyšetření k objasnění příčiny pozitivity testu.

Doporučení-guidelines pro screening definované WHO jednoznačně definují požadovaná kriteria pro test, který by mohl sloužit pro screening. Mezi tato kriteria patří vysoká senzitivita, vysoká specificita s téměř nulovou falešnou pozitivitou, nízká cena a přijatelná akceptovatelnost populací.

Citlivost-senzitivita FOBT testů a současně i jejich specificita je dána především nastavením hranice detekce, cut-off, a tedy otázka fyziologických ztrát krve - stolicí, a současně hodnoty koncentrace hemoglobinu ve vzorcích stolice u KRCA. Guajakové testy nemají téměř žádnou falešnou pozitivitu, ale při tomto nastavení TOKS mají velmi nízkou citlivost. Kvalitativní imunochemické testy mají téměř dvojnásobnou citlivost proti guajakovým testům, ale současně velmi vysokou falešnou pozitivitu dosahující až 25%. Optimálními TOKS testy jsou podle současných doporučení pouze kvantitativní imunochemické testy s automatickou analýzou koncentrace hemoglobinu, kde lze optimalizovat spolehlivost vhodným nastavením cut-off detekce Hb.

Fyziologické ztráty krve, stolicí, obrázek LG_354

Fyziologický proces definuje denní ztráty krve stolicí v objemu 0.5 - 2.5 ml. Pokud toto množství krve přepočteme koncentrací hemoglobinu v krvi (120 - 150 mg/ml), a množstvím stolice za 24 hodin (300 - 450g), pak můžeme hodnoty 0.3 - 1.3 mg hemoglobinu, na 1 g stolice, považovat za fyziologické rozmezí. Z toho vyplývá, že tuto koncentraci by testy FOBT neměly detekovat jako pozitivní nález krve ve stolici.

Koncentrace Hb ve stolici u nemocných s KRCA, obrázek LG_357

Studie prof. Ahlquista je provedena na souboru nemocných s pokročilým, a asymptomatickým (tedy bez příznaků), kolorektálním karcinomem. Test FOBT byl proveden opakovaně, hranice cut-off (detekce pozitivity FOBT) je nastavena na 2 mg Hb/g stolice. Graf současně ukazuje pozitivitu/negativitu standardního Haemoccult testu. HCCT negativních bylo 8 ze 12 nemocných. Hladina Hb ve stolici se pohybuje v rozmezí 0.1 - 10 mg Hb/g stolice. Pouze 3 nemocní, všichni HCCT pozitivní, měli všechny odebrané vzorky pozitivní s hodnotou nad 2 mg Hb/g stolice.

Koncentrace hemoglobinu ve stolici, obrázek LG_355

Schematicky lze zobrazit zeleně zdravou/fyziologickou populaci s koncentrací 0.3 - 1.3 mg Hb/g stolice. Červená křivka ukazuje koncentrace Hb u kolorektálního karcinomu. Detekční cut-off pro standardní Haemoccult test je přibližně 5 mg Hb/g stolice, nezachytí tedy všechny KRCA, ale neměl by detekovat pozitivně žádného zdravého jedince. Diskutována je hladina detekčního limitu, např. pro imunochemické testy - iFOBT. Studie Ahlquista - 2 mg Hb/g stolice. Zachytit všechny KRCA? Včetně falešné pozitivity - zdravých osob? Provedení totální kolonoskopie?

Rozdílná degradace HEMu a globinu - vliv na FOBT, obrázek LG_353

Dva rozdílné přístupy k detekci krve ve stolici jsou: - detekce hemu (pseudoperoxidázová, chemická reakce) a imunochemický průkaz proteinu - globinu. Senzitivita, pozitivní průkaz, jsou výrazně ovlivněny rozdílnou degradací obou složek hemoglobinu s ohledem na proximodistální gradient v trávicím ústrojí. Globin je degradován mnohem rychleji, a pozitivita imunochemických testů téměř eliminuje detekci krvácení v horní části trávicí trubice. Degradace hemu je výrazně pomalejší, proto chemicky orientované testy FOBT, např. Haemoccult, mohou reagovat i na krvácení z vyšších oblastí GIT.

Tři generace FOBT testů , obrázek LG_604

První generace FOBT testů, gFOBT, založená na gujakové pryskyřici byla popsána v roce 1976 a nejméně 20 let byla pro screening používána. Druhá generace FOBT testů, iFOBT, založená na imunochemické detekci proteinu-globinu z hemoglobinu zvýšila výrazně senzitivitu screeningu, ale vzhledem k vysoké falešné pozitivitě a heterogenitě metod se pro screening neprosadila. Třetí generací FOBT testů, qiFOBT, jsou od roku 2002 kvantitativní analýzy Hb ve stolici pomocí automatických analyzátorů.

Senzitivita a specificita FOBT testů tří generací, obrázek LG_626

Senzitivita gFOBT testů první generace je velmi nízká, pro detekci karcinomu je do 30%, gFOBT testy však mají téměř nulovou falešnou pozitivitu. Kvalitativní imunochemické testy iFOBT druhé generace mají senzitivitu dvojnásobnou, v našich studiích ve VFN 56.8%, jejich specificita však výrazně klesla a falešná pozitivita je u některých testů téměř 25%. Třetí generace FOBT testů qiFOBT s kvantitativní detekcí Hb ve stolici umožňuje optimalizací cut-off hodnoty zajistit senzitivitu 83.4% při současné specificitě 96.7%.

Reference
Guittet L. - Int J Cancer. 2009, Medline - link
Denters MJ. - BMC Gastroenterol. 2009, Medline - link
Parente F. - Br J Surg. 2009, Medline - link
Van Rossum LG. - Gastroenterology. 2008, Medline - link
Fraser CG. - Lancet Oncol. 2006, Medline - link
Ouyang DL. - J Gastroenterol. 2005, Medline - link
Song K. - Gastroenterology. 2004, Medline - link
Ko CW. - Am J Med. 2003, Medline - link
Walsh JM. - JAMA 2003, Medline - link
Ahlquist DA. - Clin Chim Acta 2002, Medline - link
La VC. - Ann Oncol 2002, Medline - link
Jouve JL. - Br J Cancer. 2001, Medline - link
Towler BP. - Cochrane Database Syst Rev 2000, Medline - link
Saito H. - Oncol Rep 2000, Medline - link
Faivre J. - Br J Cancer 1999, Medline - link

Guajakový test - gFOBT

Doporučeným testem pro screeningový postup
byl mnoho let pouze guajakový test - Haemoccult. Pseudoperoxidázová reakce hemoglobinu je základem testu, který obsahuje testovací médium (papírek) impregnované guajakovou pryskyřicí nebo u starších testů, derivátem benzidinu – např. dimethylbenzidinem (o-tolidin). Bezbarvá leukoforma těchto látek je v přítomnosti peroxidu vodíku a hemoglobinu oxidována na barevnou (chromogenní) formu.
Vzhledem k chemickému principu oxidační reakce jsou testy ovlivněny přítomností jiných oxidačních látek (vitamin C), přítomností hemoglobinu z potravy (maso, krev), falešně pozitivní výsledek může být způsoben i přítomností rostlinných peroxidáz (některé druhy kořenové zeleniny). V závislosti na uspořádání testu je proto doporučováno definované dietní omezení.
Citlivost testů s guajakovou pryskyřicí je řádově nižší ve srovnání s testy imunochemickými a v současné době jsou doporučeny pro screening KRCA výhradně kvantitativní imunochemické testy - qiFOBT.

Provedení testu - TOKS (Haemoccult).
Pro screening je dodávána souprava, která obsahuje 3 testy se dvěma okénky a plastové nebo dřevěné špátle na odběr stolice. Pacient odebere vždy dva různé vzorky ze tří po sobě následujících stolicí, které rozetře na označená místa testu, testovací okénka uzavře a testy odešle do laboratoře. Laboratorní zpracování spočívá v aplikaci detekčního reagens na opačnou stranu okének a zhodnocení případné barevné změny. Hodnocení je kvalitativní, jako pozitivní je hodnocen každý test, kde dochází ke specifickému modro-zelenému zabarvení.

FOBT s guajakovou pryskyřicí, obrázek LG_348

Standardní testy okultního krvácení - TOKS, Haemoccult test, jsou založeny na chemickém principu, pseudoperoxidázové reakci hemoglobinu. Substrátem byl původně benzidin, jako kancerogen byl modifikován na nekancerogenní dimethylbenzidin - oTolidin (např. německý KryptoHaem), nebo tetrametylbenzidin TMB. Dnes jsou používány testy s guajakovou pryskyřicí - z Guajacum officinale/sanctum - obsahující guajakol (o-metoxy-fenol), tedy substrát benzidinového typu. V leuko-formě je bezbarvý, oxidován se zbarvuje do modrozelena. Oxidace probíhá peroxidem vodíku, katalyzátorem je hemoglobin s pseudoperoxidázovou aktivitou. Testy s guajakovou pryskyřicí tedy samozřejmě budou reagovat na přítomnost jiných látek ovlivňujících tuto oxidační reakci - kořenová zelenina, železo, C-vitamin apod.

FOBT testy s guajakovou pryskyřicí, obrázek LG_347

Testy FOBT založené na chemickém průkazu, pseudoperoxidázové aktivitě hemoglobinu, vyrábí celá řada firem (Haemoccult, HemDetect, TriSlide, HemoCare, ColoScreen, Hema-Check a další. Většina testů obsahuje 3 testovací "psaníčka" většinou se dvěma okénky, tedy umožňující odebrat 6 vzorků stolice. Jediným testem, který obsahovat o-tolidin byl německý KryptoHaem SSW firmy Germed (DDR).

Provedení Haemoccult - TOKS - testu, obrázek LG_349

Standardní postup TOKS testu vyžaduje odběr 6ti vzorků stolice, ze tří po sobě následujících stolicí. Z každé stolice mají být odebrány dva vzorky (z obou konců stolice) a pomocí dřevěné špátle jemně rozetřeny na okénka v testovacím "psaníčku". Haemoccult test obsahuje tři "psaníčka", pacient každé z nich označí datem, pořadím a jménem.
Podrobný popis, návod pro nemocné, je popsán v dokumentu - FOBT test ÚKBLD.

Home-care test, obrázek LG_372

Na chemickém principu detekce krve ve stolici - guajakový test - je založen i test EZ Detect, 2 minutový, chromogenní test určený k provedení v domácnosti. Pacient sám test provede i vyhodnotí. Test je vyroben z biodegradovatelného materiálu, substrátem je tetrametylbenzidin (TMB).
Z pohledu lékaře, pro doporučení vhodného testu, zahrnuje databáze odborných sdělení NLM Medline 2131 článků s problematikou detekce okultního krvácení, ale pouze dva články věnované testu EZ Detect.

Reference
Hewitson P. - Am J Gastroenterol. 2008, Medline - link
Cruz-Correa M. - Dig Dis Sci. 2007, Medline - link
Berchi C. - Health Econ. 2004, Medline - link
Rasmussen M. - Scand J Gastroenterol. 2003, Medline - link
Jorgensen OD. - Gut 2002, Medline - link
Jouve JL. - Br J Cancer 2001, Medline - link
Kristinsson J. - Digestion 2001, Medline - link
Towler BP. - Cochrane Database Syst Rev 2000, Medline - link
Mandel JS. - J Natl Cancer Inst 1999, Medline - link

Imunochemické testy krve ve stolici, kvalitativní - iFOBT

Citlivý diagnostický test okultního krvácení je založen na imunochemické detekci hemoglobinu reakcí s monoklonální protilátkou proti lidskému hemoglobinu. Na imunochemickém principu jsou založeny testy hemaglutinační, latexové imunoprecipitace, radiální imunodifúze a imunoafinitní chromatografie. Detekce proteinu (lidského hemoglobinu) monoklonální protilátkou vylučuje možnost ovlivnění jiným zdrojem hemoglobinu (potrava), odpadá interference chemických látek, není nutná speciální dieta. Citlivost imunochemických testů je výrazně vyšší; v závislosti na technice i < 0,1 mg hemoglobinu / g stolice. K imunochemickým testům patří např. latexový test Hemolex, Heme-Select na principu reversní pasivní hemaglutinace nebo ImmoCare na bázi imunoafinitní chromatografie.

Provedení iFOBT testu. Imunochemické testy se výrazně liší podle typu použité techniky. V poslední době je nejrozšířenější varianta imunoafinitní chromatografie. Pacient odebere 1 vzorek stolice do odběrové nádobky se stabilizujícím roztokem. Laboratorní zpracování spočívá v aplikaci kapky extraktu na test a odečtení 1 nebo 2 barevných proužků, které detekují přítomnost pouze protilátky s barevným markerem (negativní test, 1 barevný proužek) nebo vznik komplexu antigenu-protilátky (pozitivní test, 2 barevné proužky). Hodnocení iFOBT testu je zásadně kvalitativní, a předpokládá definovanou cut-off hodnotu pozitivity testu. Výsledek testu může býti falešně pozitivní při vyšší koncentraci vzorku stolice v extrakčním pufru, např. nesprávně provedeným odběrem stolice. Při hodnocení imunochemických testů iFOBT je nutno zvažovat i možnost falešně negativních nálezů vzniklých tzv. "hook efektem". Při velmi vysoké koncentraci antigenu - hemoglobinu dojde k maximálnímu vyvázání protilátek a negativnímu zobrazení testu.

Hemolex - latexový iFOBT, obrázek LG_361

Imunochemický průkaz krve ve stolici založený na latexové reakci protilátek k lidskému hemoglobinu - test Hemolex, výrobce Orion Diagnostica, Finsko. Jednoduchý, spolehlivý test, dobře hodnotitelný - detekcí precipitace latexových částic, citlivost testu je nastavena na 1 mg Hb/g stolice. Odběrový systém testu je velmi spolehlivý, odběr stolice lžičkou, definující množství stolice, relativně značné zředění 20 ml reagenčního pufru, víčko odběrové nádobky zahrnuje mikrofiltrační membránu. Naše studie prokázala citlivost Hemolexu 48,6% (oproti TOKS Haemoccultu s 28,7%) a falešnou pozitivitu testu 10,0%.

Imunochromatografické iFOBT testy, obrázek LG_363

Imunochromatografický test - Actim Fecal Blood, výrobce Medix Biochemica, Finsko. Citlivost testu je 25-50 ug Hb/g stolice, při hodnocení testu nedochází k žádnému kontaktu s odebranou stolicí, do kontaineru s extraktem stolice je vlomením víčka zasunut detekční proužek. Naše studie prokázala citlivost Actim Fecal Blood testu 55,7% (oproti TOKS Haemoccultu s 28,7%) a falešnou pozitivtu testu 6,4%.
Imunochromatografický test - Hexagon OBTI, výrobce Human GmbH, Německo. Test zahrnuje běžně používanou kombinaci odběrové lahvičky a imunochromatografickou kazetu, hodnocení testu je velmi dobré, naše studie prokázala citlivost Hemolexu 68,4% (oproti TOKS Haemoccultu s 28,7%) a falešnou pozitivitu testu 11,5%.

HemeSelect - RPHA test iFOBT, obrázek LG_364

Imunologický průkaz krve ve stolici je v HemeSelect testu řešen reverzně pasivní hemaglutinací. Test HemeSelect, výrobce Smith-Kline Diagnostica, citlivost uvedená výrobcem je 10 ug Hb/g stolice. Odběr stolice je řešen nanesením stolice na odběrový filtrační papírek, s definovanými separovatelnými kroužky. Takto odebraná stolice je vložena do klasické 96ti jamkové destičky (ELISA typ), kde provedeme několikanásobné, postupné ředění vzorku a detekci aglutinace. Hodnocení je možné vizuálně (značné obtížné), nebo na ELISA readeru se specifickým SE pro hodnocení aglutinace. Naše studie prokázala citlivost Hemolexu 49,3% (oproti TOKS Haemoccultu s 28,7%) a velmi vysokou falešnou pozitivitu testu 27,6% - pravděpodobně díky vysoké analytické citlivosti testu.

Odběrové nádobky pro iFOBT testy, obrázek LG_360

Odběr stolice pro iFOBT testy může výrazně ovlivnit výsledek testu, jak negativně, tak pozitivně. Pre-analytická fáze testu je zcela mimo možnosti laboratorní kontroly. Odběrový systém může tuto fázi testu podstatně zlepšit. Většina iFOBT testů dodává relativně jednoduchý odběrový systém - kontainer s plastovým kartáčkem pro odběr stolice. Řada pacientů použije kartáček vícekrát, s pocitem dodání dostatečného množství stolice. Jsou i pacienti, kteří naplní kontainer stolicí a vylejí extrakční pufr. Velmi vhodný systém nabízí firma Orion-test Hemolex, s odběrovou lžičkou a velkým objemem extrakčního pufru. Vhodné jsou i kontainery s plastovým septem, který definuje množství stolice pro vlastní extrakci.

Citlivost-hodnocení iFOBT testů, obrázek LG_359

Imunochromatografické testy hodnotíme přítomností pozitivního proužku v oblasti testu na iFOBT proužku. Hodnocení je zásadně vizuelní. Spolehlivě lze vyhodnotit pozitivitu testu s koncentrací 0,1 mg Hb/g stolice (vedle je zobrazena pozitivita standardního TOKS Haemoccult test s citlivostí 5-10 mg Hb/g stolice). Horní kazeta zachycuje hraniční citlivost testu 200x nižší, 500 ng Hb/g stolice, dolní kazeta ukazuje riziko falešné negativity - "hook efekt" a pozitivitu testu při 100x vyšší koncentraci antigenu - 10 mg Hb/g stolice.

Reference
Terhaar sive Droste JS. - Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011, Medline - link
Haug U. - Am J Gastroenterol. 2010, Medline - link
Berchi C. - Int J Technol Assess Health Care. 2010, Medline - link
Levi Z. - Int J Cancer. 2010, Medline - link
Guittet L. - Int J Cancer. 2009, Medline - link
Denters MJ. - BMC Gastroenterol. 2009, Medline - link
Parente F. - Br J Surg. 2009, Medline - link
Fraser CG. - Gut. 2007, Medline - link
Ciatto S. - Br J Cancer. 2007, Medline - link
Li S. - Int J Cancer. 2006, Medline - link
Greenwald B. - Gastroenterol Nurs. 2005, Medline - link
Morikawa T. - Gastroenterology. 2005, Medline - link
Bampton PA. - Gut. 2005, Medline - link
Vogel T. - Dtsch Med Wochenschr. 2005, Medline - link
Bardot L. - Ann Biol Clin (Paris). 2004, Medline - link
Berchi C. - Health Econ. 2004, Medline - link
Nakajima M. - Br J Cancer. 2003, Medline - link
Wong BC. - Aliment Pharmacol Ther. 2003, Medline - link
Dvorak M. - Cas Lek Cesk 2002, Medline - link
Harewood GC. - Mayo Clin Proc 2002, Medline - link
Saito H. - Oncol Rep 2000, Medline - link
Castiglione G. - J Med Screen 2000, Medline - link

Hemoporfyrinový test detekce krve ve stolici

Vysoce citlivým testem pro detekci krve ve stolici je stanovení porfyrinovou metodou. Hematoporfyrin není v trávicím traktu degradován, na rozdíl od hemu nebo globinu, a je proto velmi spolehlivý i pro detekci krve z horní části trávicí trubice. Porfyrinovým testem je např. HemoQuant™ založený na detekci dicarboxylového porfyrinu (hematoporfyrin), který silně absorbuje 402nm s fluorescencí při 653 nm. Citlivost testu HemoQuant™ zajišťuje 100% detekce při krvácení s 15 ml krve v HČTT. Studie porovnávající detekci krvácení do HČTT u 56 nemocných prokázala spolehlivost testu HemoQuant™ v 88%, zatímco Haemoccult byl pozitivní jen ve 26%.

Hemoporfyrinový test detekce krve ve stolici, obrázek LG_470

Porfyrinový test na detekci krve ve stolici - fluorescenční metoda HemoQuant™ . Test zahrnuje konverzi hemu na dicarboxylový porfyrin (hematoporfyrin), který silně absorbuje 402nm s fluorescencí při 653 nm Metoda je laboratorně náročná a test není doporučen pro screeningové postupy.

Reference
Barber MD. - J R Coll Surg Edinb. 2002, Medline - link
Harewood GC. - Mayo Clin Proc. 2002, Medline - link
Harewood GC. - Dig Dis. 2000, Medline - link
Rockey DC. - Am J Gastroenterol. 1999, Medline - link

Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici - qi-FOBT

Studie v posledních letech testují několik imunochemických analyzátorů pro kvantitativní stanovení krve ve stolici, většina je japonské výroby. ROC křivky prokazují specificitu pro pokročilé adenomy 95.3% při citlivosti 100 ng Hb/mL. Automatizace laboratorních technologií ovlivnila také vývoj systémů na zpracování vzorků stolice a detekci krve ve stolici. Existují jednoduché ruční analyzátory na kvantifikaci iFOBT, existují i komplexní analyzátory pracující s primárním vzorkem - vzorkem stolice. Nastavení citlivosti těchto analyzátorů a hodnocení pozitivity nálezu je dosud diskutovaným tématem - viz obr. LG_355.

Stanovení hemoglobinu ve stolici, kvantitativní stanovení, je nejpřesnější metodou stanovení okultního krvácení, metodou vhodnou pro screening kolorektálních nádorů - KRCA. Dosud používaný guajakový Haemoccult test - gFOBT je málo citlivý, ovlivnitelný dietou a v řadě zemí je nahražován immunochemickým testem - iFOBT, prokazujícím hemoglobin pomocí rychlých (rapid) testů s monoklonální protilátkou. Kvantitativní stanovení hemoglobinu koreluje s mírou krvácení prekanceróz (adenomů) a nádorů tlustého střeva. Studie z posledních let testují několik imunochemických analyzátorů pro kvantitativní stanovení krve ve stolici, většina je japonské výroby. ROC křivky prokazují specificitu pro pokročilé adenomy 95.3% při citlivosti 100 ng Hb/mL.

Kvantitativní stanovení lidského hemoglobinu ve stolici je založeno na aglutinační, latexové rekaci s protilátkou k A0 lidskému hemoglobinu. Metoda stanovuje hemoglobin s polyklonální protilátkou k Hb A0 IgG - resp. s mnohanásobnou monoklonální protilátkou. (Monoklonální protilátka reaguje pouze s jedním epitopem, polyklonální protilátka reaguje běžně s různými epitopy, protilátka pro tuto analýzu vyžaduje vícenásobnou reakci pro aglutanační aktivitu, tedy mnohanásobnou monoklonální reakci). Vlastní analýza je prováděna turbidimetrickým měřením při 600 nm, kalibrace je většinou několikabodová v rozsahu 20 - 2000 ng Hb/ml. Kvantitativní analýza umožňuje, oproti kvalitativním - rapid testům - definovat optimální cut-off hodnotu.

QuikRead FOB test Orion, obrázek LG_362

Firma Orion Diagnostika nabízí jednoduchý, semikvantitativní, imunoturbidimetrický test iFOBT. Odběrový systém zahrnuje plastový kontainer s extrakčním pufrem (QuikRead FOB/Hemolex Sampling Set Vials), hodnocení testu provádí rapid-test systém QuikRead. Citlivost testu je nastavena magnetickou kartou, na 1 mg Hb/g stolice, rozsah detekce je 1-100 mg Hb/g stolice. Výsledek testu je zobrazen do 3 minut.

Imunochemické analyzátory pro stanovení Hb ve stolici, obrázek LG_366

Automatické analyzátory pro kvantitativní stanovení Hb ve vzorku stolice vyrábí již 6 firem, většina v Japonsku a 3 komunikují pouze japonsky. V Evropě je dostupný systém OC-Senzor-mí (Eiken) distribuovaný v České republice firmou Dialab, HM Jack Kyowa, a italský FOB Gold-Sentinel. Další uvedené analyzátory existující pouze v japonské verzi nemají zatím zastoupení v Evropě. Citlivost analyzátorů je definována v ng/ml reagenčního roztoku.

Stanovení Hb ve stolici - diagnostická specificita, obrázek LG_489

Studie provedená na pracovišti prof.Rozena (Tel Aviv) demonstruje korelaci - závislost detekovaného množství lidského hemoglobinu ve stolici v souboru zdravých kontrol (normální nález při kolonoskopii - 25 až 45 ng Hb/ml), 140 - 263 ng Hb/ml u nemocných s prokázaným polypem, adenomem tlustého střeva, 315 - 654 ng Hb/ml u pacientů s adenomem pokročilým, s vyšším rizikem malignity a vysoké hodnoty 697 - 1477 ng Hb/ml u prokázaných kolorektálních nádorů.
Optimalizace nastavení cut-off hodnoty, obrázek LG_478

Kvantitativní stanovení hemoglobinu nabízí oproti kvalitativnímu průkazu (negativní - pozitivní) možnost vlastního nastavení, optimalizace metody, volbou cut-off hodnoty. Studie provedená na pracovišti prof.Rozena (Tel Aviv) zobrazuje hodnoty specificity a senzitivity (závislost ROC křivky) v rozmezí hodnot cut-off 50 - 200 ng Hb/ml, při použití automatického analyzátoru OC Senzor - Eiken, Japonsko.

Odběrová kazetka pro vzorek stolice , obrázek LG_487 zajišťuje kvantitativní aspekt odběru stolice na 10 mg vzorku, extrakci stolice ve 2 ml stabilizujícího pufru, filtraci analytu a přímý odběr extraktu do reakční kyvety analyzátoru. Příkladem je odběrový systém pro analyzátor OC-Senzor (Eiken - Japonsko). Odebraná stolice (20 - 200 mg) na odběrovém kartáčku je po zasunutí do kazety protlačena přesně definovaným septem, které zajišťuje extrakci 10 mg stolice (s cca 10% chybou) ve 2 ml stabilizujícího tlumiče. V analyzátoru je mechanickým tlakem kazeta stisknuta a dochází k protlačení extraktu stolice filtrem do nástřikové jamky pod aluminiovou fólií. Tato fólie je perforována a nástřik 25 ul extraktu je jehlou aplikován do měřicí kyvety.

Reference
Sobhani I. - Dis Colon Rectum. 2011, Medline - link
Guittet L. - Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011, Medline - link
Lee CS. - J Clin Pathol. 2011, Medline - link
van Rossum LG. - Int J Cancer. 2010, Medline - link
Van Rossum LG. - Gastroenterology. 2008, Medline - link
Ciatto S. - Br J Cancer. 2007, Medline - link
Levi Z. - Ann Intern Med. 2007, Medline - link
Fraser CG. - Lancet Oncol. 2006, Medline - link
Rozen P. - Med Sci Monit. 2006, Medline - link
Wong WM. - Cancer 2003, Medline - link
Nakama H. - Eur J Cancer. 2001, Medline - link

Molekulární gentika a DNA markery kolorektálních tumorů

Biologický proces vývoje kolorektálního karcinomu - z adenomu - trvá řádově několik let. Screening je proto primárně nastaven na detekci intermitentně krvácejících adenomů. Rozvoj molekulární biologie a aplikace typu PCR v rutinní diagnostice otevírají zcela nové trendy i ve screeningu tumorů GIT. Nejnovější screeningové metody jsou založeny na detekci specifických mutací metodami PCR nebo biochipovou technologií v DNA izolované ze vzorku stolice.

V posledních letech se objevila možnost diagnostikovat karcinom na podkladě genetického vyšetření stolice. DNA z odloupnutých epitelií se stanovuje mimořádně citlivými metodami, které využívají amplifikaci PCR. Vzhledem ke genetické heterogenitě nelze u žádného markeru očekávat 100% senzitivitu, a využívají se proto vypočtené genetické soubory. Vyšetření je přijímáno dobře. Nepožadují se restrikce v dietě ani v medikaci, ani jakákoliv příprava. Bylo vyzkoušeno několik různých prototypů hodnotících mutace p53, APC a k-ras genů, Bat-26 mikrosatelitní nestabilitu a »dlouhou« DNA. V současnosti je již komerčně dostupný PreGenPlus test (EXACT Sciences nad LabCorp). Probíhá řada studií, specificita se pohybuje kolem 90–100 % a senzitivita je několikanásobně vyšší než u guajakových testů.

Molekulárními markery kolorektálního karcinomu může být také detekce metylace specifických proteinů, např. vimentinu, a tyto DNA změny lze monitorovat jak ve stolici, tak i v séru nemocných s KRCA. Test - ColoSure - detekuje ve vzorcích stolice tyto genetické markery.

Genetické markery kolorektálního karcinomu, obrázek LG_343

Proces vzniku kolorektálního karcinomu v sekvenci adenom - karcinom. Molekulární biologie dnes nabízí možnost detekce jednotlivých genetických markerů tohoto procesu - ztráta/mutace APC na genu 5q, overexprese COX-2, aktivace/mutace K-ras na genu 12q, ztráta/mutace p53 na genu 17p, ztráta DCC na genu 18q. Genové mutace lze detekovat v bioptickém vzorku tkáně tlustého střeva nebo ve vzorku stolice po izolaci DNA z epitelií kolonické sliznice.

QIAamp DNA Stool Mini Kit , obrázek LG_381

Qiagen nabízí komerční soupravu pro izolaci a přípravu DNA ze vzorků stolice. Proces zajišťuje izolaci 10 -30 ug DNA ze vzorku 220 mg stolice, během 50 minutového procesu. Tento proces zajišťuje také odstranění inhibitorů pro další PCR analytiku.

DNA chip pro mutace p53, obrázek LG_382

Studie Americké společnosti pro klinickou onkologii (ASCO) z června 2006 zdůrazňuje možnosti klinického použití detekcí mutací p53 pro nemocné se skvamózním karcinomem. Komerční DNA chip pro detekci mutací p53 (gp53) nabízí firma Affymetrix. DNA diagnostika genových mutací - proveditelná již i ze vzorků stolice - je jednou z možných variant screeningu kolorektálních nádorů.

PreGen-Plus DNA chip, obrázek LG_385

Komplexní detekce genetických markerů kolorektálního karcinomu nabízí PreGen-Plus test. Zahrnuje 21 mutací APC, K-ras a p53, a detekci mikrosatelitní instability markerem BAT-26. PreGen-Plus test provedený ve vzorku stolice je 4x citlivější než standardní FOBT test detekce okultního krvácení - porovnáváno s testem Haemoccult-II. Perspektivní aplikace kombinovaných DNA chipů bude pravděpodobně jednou z variant screeningových testů nádorů tlustého střeva.

Reference
Ned RM. - Colorectal Cancer 2011, Medline - link
Shirahata A. - Anticancer Res. 2010, Medline - link
Calistri D. - Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2010, Medline - link
An SW. - Yonsei Med J. 2009, Medline - link
Zou H. - Gastroenterology. 2009, Medline - link
Calistri D. - Cell Oncol. 2009, Medline - link
Rennert G. - Cancer Lett. 2007, Medline - link
Haug U. - Clin Chem. 2007, Medline - link
Matsushita H. - Gastroenterology 2005, Medline - link
Greenwald B. - Gastroenterol Nurs. 2005, Medline - link
Ouyang DL. - J Gastroenterol. 2005, Medline - link
Whitney D. - J Mol Diagn. 2004, Medline - link
Imperiale TF. - N Eng J Medicine 2004, Medline - link
Brand RE. - Am J Gastroenterol. 2004, Medline - link
Berchi C. - Health Econ. 2004, Medline - link
Song K. - Gastroenterology. 2004, Medline - link
Helm J. - Cancer Control. 2003, Medline - link
Levin B. - CA Cancer J Clin. 2003, Medline - link
Atkin W. - Scand J Gastroenterol Suppl. 2003, Medline - link
Nishikawa T. - Clin Chim Acta 2002, Medline - link
Prix L - Clin Chem 2002, Medline - link

Edukační zdroje autora on-line

GastroLab - miniencyklopedie laboratorní diagnostiky v gastroenterologii, popis cca 50 metodik, nejnovější reference s přímou on-line vazbou na abstrakta v databázi Medline. Text je doplněn řadou obrázků z PowerPoint výukových prezentací. Virtuální adresou je http://gelab.zde.cz.

GastroPoint - Laboratorní diagnostika v gastroenterologii, kompletní zdroj 650 grafů a schémat v PowerPoint prezentaci, převedené do PDF souboru, soubor má 40 MB, poslední aktualizace je z června 2011. Jednotlivé, dílčí PowerPoint prezentace z oblasti gastroenterologie jsou zveřejněny na serveru ÚKBLD 1.LF UK - Přednášky v PowerPointu.

GastroWeb - internetový portál pro gastroenterology, více než 150 odkazů na internetové stránky pro gastroenterologii. nabídka českých a zahraničních časopisů, přímé odkazy na abstrakta a full-text článků z gastroenterologie, klinické biochemie, imunologie a dalších oborů. Každý měsíc aktuální novinky z domova nebo ze světa. 141 vybraných (přeložených) abstrakt z českých i zahraničních časopisů věnovaných gastroenterologii. Přehled kongresů a odborných setkání. Poslední aktualizace 29. června 2011. Virtuální adresou je http://gweb.zde.cz.

DigiHerbář - pro zpestření výuky Vám nabízím, máte-li rádi přírodu, digitální herbář - 2500 fotografií rostlin a květů, vzácných, jedovatých, léčivých i exotických z mnoha zemí světa, v on-line databázi, botanicky popsané s latinským a českým názvem, internetové odkazy na další zdroje, botanické zahrady v České republice i v zahraničí. Virtuální adresou je http://herbar.virt.cz.



Autor textu i obrázků: as.MUDr.Petr Kocna CSc. - eMail: kocna@cesnet.cz
HomePage: kocna.zde.cz
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 Unported License. Creative Commons License